اساس اندازه گيري پروتئين در ادرار به صورت كمي و نيمه كمي و كيفي بر پايه روشهاي ايمونوشيمي، كدورت سنجي و شيميايي با استفاده از نوارهاي تشخيصي مي باشد. در اين ميان روش كدورت سنجي به علت ساده و مقرون به صرفه بودن در آزمايشگاهها كاربرد بيشتري دارد. با توجه به تحقيقات انجام شده در آزمايشگاه رفرانس (2) روش TCA با استفاده از طول موج 405 نانومتر براي سنجش مقادير كم پروتئين بعنوان روش انتخابي معرفي مي شود. نكات مورد توجه در معرفي روش پيشنهادي عبارتند از :

ضمناً در بررسي روشها، عوامل كيفي شامل صحت، دقت، محدوده اندازه گيري، خطي بودن و يكنواختي نتايج در استفاده از كاليبراتورهاي متفاوت تعيين گرديده و سپس روش اصلح انتخاب شده است.

در اين روش پروتئين ادرار توسط تري كلرواستيك اسيد 12.5% رسوب داده مي شود. كدورت ايجاد شده متناسب با مقدار پروتئين (آلبومين و گلبولين) موجود در ادرار است. غلظت پروتئين رسوب داده شده با در نظر گرفتن غلظت اسيد، دما و زمان سپري شدن بين اضافه كردن اسيد تا ايجاد رسوب پروتئين محاسبه مي گردد.

جمع آوري نمونه

در اين آزمايش مي توان از ادرار بصورت انتخابي (Random) استفاده كرد ولي ادرار 12 يا 24 ساعته ترجيح داده مي شود. البته نمونه ادرار 12 يا 24 ساعته بايد بدون افزودن ماده نگهدارنده جمع آوري شده و در تمام مدت نمونه گيري، ظرف حاوي نمونه در محل خنك نگهداري شود. براي جمع آوري بايد از ظرف تميز و عاري از آلودگي استفاده نمود و به بيمار آموزش داده شود كه براي جمع آوري ادرار 24 ساعته، از ساعت 8 صبح تا 8 صبح روز بعد تمامي نمونه هاي پس از ساعت 8 بطور كامل جمع آوري شده ولي ادرار ساعت 8 صبح روز اول جمع آوري نگردد. بايد توجه نمود كه اگر اندازه گيري پروتئين ادرار در مدت 48 ساعت پس از نمونه گيري انجام نمي شود، مي توان نمونه را خوب مخلوط كرده و پس از تعيين حجم نمونه، بخشي از آن را تا روز انجام آزمايش در فريزر نگهداري نمود.

طرز تهيه TCA 100% ذخيره :

توجه: به علت حالت خورندگي TCA بايد تهيه محلول با احتياط و با محافظت از چشمها و دستها انجام گيرد و پس از پايان كار ظروف مورد استفاده كاملاً شسته شوند.

175ml آب مقطر ديونيزه شده را به يك ظرف حاوي 500g از TCA اضافه مي كنيم. درب ظرف را بسته و به آرامي تكان مي دهيم تا كاملاً حل شود. سپس تمام مواد را به طور كامل به يك بالن 500ml  حجمي منتقل مي كنيم و حجم كل را به 500ml مي رسانيم. براي انحلال كامل طي مدت 24 ساعت، محلول راگهگاه با عمل چرخش مخلوط مي نمائيم.

محلول TCA 100% را در يك ظرف تيره و در دماي اتاق نگهداري مي كنيم. اين محلول براي 12 ماه پايدار است.

طرز تهيه ( TCA 12.5%)

با استفاده از پيپت حجمي 25 ميلي متري، مقدار 25ml از محلول TCA100% را به بالن ژوژه200 ميلي ليتري منتقل مي نماييم و با استفاده از آب مقطر حجم آن را به 200ml مي رسانيم. محلول حاصله را كاملاً مخلوط كرده و در ظرف شيشه اي تيره در دماي اتاق نگهداري مي نماييم. اين محلول در دماي اتاق به مدت يك ماه پايدار است.

كنترل :

از سرم كنترلهاي تجاري به عنوان كنترل استفاده مي گردد (رقتي برابر1/300 با استفاده از سرم فيزيولوژي تهيه مي شود).

استاندارد :

براي آزمايشهاي روتين (روزانه) از سرم كنترلهايي ترجيحاً با ارزش مرجع مانند precipath و  Bioradو precinorm مشابه استفاده مي شود. براي انجام كار ابتدا غلظت پروتئين اين سرم كنترلها را به مقداري كه امكان وجود آن در ادرار است مي رسانيم. (براي رقيق كردن از سرم فيزيولوژي استفاده ميشود)

لاز به ذكر است ك اين روش تا 500mg/L خطي ميباشد، بنابراين نمونه ها اعم از ادرار و استاندارد بايد طوري رقيق شود كه غلظت پروتئين موجود در آنها حداكثر 500mg/L باشد.

توجه: از يك نوع نمونه كنترل نمي توان همزمان بعنوان كنترل و استاندارد استفاده نمود.

روش كار

1 - 10 ml از ادرار مورد آزمايش را سانتريفوژ نموده سپس با استفاده از نوار ادراري پروتئين آن را بررسي مي كنيم و نتيجه را ثبت مي نماييم. اگر غلظت پروتئين بيش از 1+ بود نمونه ادرار را قبل از شروع آزمايش با سرم فيزيولوژي رقيق ميكنيم. (نمونه هاي 1+ تقريباً به نسبت 1/50 و نمونه هاي 2+ تقريباً 1/10 و نمونه هاي 3+ تقريباً 1/15 رقيق مي شوند). اگر نيتريت ادرار مثبت باشد، مي بايد بيمار را براي نمونه گيري مجدد با رعايت شرايط نمونه گيري راهنمايي نموده و در صورت تكرار آلودگي نمونه، بيمار جهت مشاوره و لزوم بررسي نتايج كامل ادرار و احتمالاً درخواست كشت به پزشك معرفي گردد.

2 - براي هر آزمايش (نمونه، كنترل و استاندارد) دو لوله در نظر مي گيريم (يكي به عنوان بلانك و ديگري به عنوان آزمايش)

3 - 1.6ml از نمونه ادرار، استاندارد و كنترل را در لوله هاي مربوطه ريخته و سپس 0.4ml از محلول TCA12.5% به همه لوله ها اضافه مي نماييم. به آرامي لوله ها را مخلوط كرده (بهتر است سرلوله ها را با پارافيلم مسدود نموده و با واژگون كردن لوله ها آنها را مخلوط نماييم).

دما در اين مرحله مؤثر بوده و مي بايد بين 23 تا 27 درجه سانتي گراد باشد.

لوله هاي بلانك را بعد از مدت 20 دقيقه به مدت 10 دقيقه با دور 1500 سانتريفوژ مينماييم.

لوله هاي آزمايش را بعد از 35 دقيقه كاملاً مخلوط نموده و جذب نوري آنها را در طول موج 405 يا 450nm در مقابل مايع رويي بلانك مربوطه بدست مي آوريم.

رعايت زمان 35 دقيقه براي اين آزمايش ضروري مي باشد.

محاسبه :

mg/24h پروتئين = ضريب رقت نمونه * حجم ادرار 24 ساعته (ميلي ليتر) * F * جذب نوري آزمايش

دامنه مرجع

با توجه به توانائي اين روش براي سنجش مقادير كم پروتئين (حدود 25 ميلي گرم در ليتر پروتئين و بيشتر)، از اين روش مي توان براي غربالگري وضعيت كليوي جمعيتهاي مستعد به بيماري كليوي مانند مبتلايان به ديابت در راستاي بررسي ميكروپروتئينوري استفاده نمود.

در افراد سالم مقدار دفع پروتئين تام تا 150mg/L در ادرار طبيعي مي باشد.

نكات قابل توجه :

* كدورت حاصله از اضافه شدن TCA به ادرار به دليل وجود آلبومين و گلبولين مي باشد.

* هر نمونه بايد در مقابل بلانك مربوط به خود اندازه گيري شود.

* PH  قليايي و پيگمانهاي ادرار باعث ايجاد نتايج مثبت كاذب مي شود.

* دفع پروتئين در ادرار به طور دائم ثابت و مشخص نمي باشد و در دوره هاي24 ساعته تغيير قابل ملاحظه اي دارد. بنابراين براي اندازه گيري پروتئين دفع شده بهتر است از ادرار 24 ساعته استفاده نمود.

* ممكن است بين نتايج بدست آمده از روش كدورت سنجي TCA و بررسي ادرار توسط نوارهاي ادراري تفاوت وجود داشته باشد. مشاهده نتايج منفي يا مقادير كمي پروتئين با نوار ادراري و نتيجه مثبت با روش TCA به طور همزمان ممكن است به دلايل زير باشد :

وجود پروتئين Myeloma (گاما گلبولين و پروتئين بنس جونز) در ادرار.

نمونه هاي غير هموژن به علت استفده از داروهاي خاص مانند Tolmetin و داروهاي ضدالتهاب كه در درمان آرتريت روماتوئيد استفاده مي شود. متابوليتهاي اين داروها مي تواند باعث ايجاد نتايج مثبت كاذب شود.

Reference:

1 - CLINICAL CHEMISTRY / LAWRENCE A.KAPLAN 1989 P: 1062-1064.

2 - TIETZ TEXTBOOK OF CLINICAL CHEMISTRY 1992 P: 717-722.